Präzise Erbgut-Schere

So schürfen nun die Goldgräber im Genom

Von Hildegard Kaulen
23.04.2015
, 22:59
Unser Genom: Auf diesem Objektträger befinden sich Chromosomen zur Untersuchung
Selten wurden in den Lebenswissenschaften spezielle Methoden so schnell so hochgejubelt wie die neuen Präzisionsscheren der Gentechnik. Alles geht, lautet das Motto. Alles? Ethisch besteht Diskussionsbedarf, politisch sowieso.

Die Biowissenschaften sind nur so gut wie ihr Handwerkszeug - und das arbeitet manchmal verblüffend effizient. So gut, dass die gesamte Branche schnell spürt, einen Riesenschritt nach vorne zu machen. Das war bei den Restriktionsenzymen so, ohne die es keinen Einstieg in die Gentechnik gegeben hätte. Ohne die modernen Sequenziertechniken gäbe es keine individualisierte Medizin, und ohne PCR würden Täter nicht anhand ihrer Haare oder anderer Gewebespuren identifiziert werden. Die Kriminalistik müsste sich dann immer noch mit den Blutgruppen begnügen.

Jetzt erleben die Biowissenschaften wieder einen großen Sprung, und es ist wieder ein neues Werkzeug, das ihn einläutet. Nicht einmal drei Jahre nach der Entdeckung seines Potentials ist schon von einem möglichen Nobelpreis die Rede. Das neue Werkzeug, das den wenig erhellenden Namen CRISPR-Cas9 trägt und ursprünglich aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes stammt, editiert und redigiert Genome punktgenau. Es ist ein Präzisionsskalpell für den Eingriff ins Erbgut, auf das die Biowissenschaften schon lange gewartet haben. Eine kurze RNA dirigiert CRISPR-Cas9 zielsicher zu einer komplementären DNA-Sequenz im Genom. Dort lagert es sich über eine Watson-Crick-Paarung an den passenden DNA-Einzelstrang an und zerschneidet danach beide Stränge mit einem glatten Schnitt. Editiert wird das Genom bei der Reparatur dieser offenen Doppelstrang-Enden. CRISPR-Cas9 ist so einfach zu bedienen und dabei so effizient, dass damit quasi jeder zelluläre Bauplan im Kern überarbeitet werden kann, auch die DNA der Keimbahn. Damit ist erstmals eine Situation eingetreten, in der theoretisch jeder beliebige Laborant mit molekularbiologischem Sachverstand eine Keimbahntherapie in Angriff nehmen könnte. Oder gentechnisch veränderte Pflanzen herstellen könnte.

Kein Science Fiction mehr

Selbst die generationenübergreifende Veränderung des menschlichen Erbguts gehört damit definitiv nicht mehr in die Welt des Science Fiction. Im Grunde weiß niemand so recht, ob sich nicht schon jemand an die Arbeit gemacht hat und ob bald ein Kind mit redigiertem Erbgut zur Welt kommen wird. Vor einigen Wochen haben deshalb führende Wissenschaftler zu einer Diskussion über die künftige Nutzung der CRISPR-Technologie aufgerufen, ähnlich wie 1975 im kalifornischen Asilomar, als die Gentechnik in den Startlöchern steckte (siehe F.A.Z. vom 20. März). Die achtzehnköpfige Gruppe spricht sich in „Science“ strikt gegen jede Form der Keimbahntherapie beim Menschen aus, meidet allerdings das Wort Moratorium. Sie wünscht sich einen freiwilligen Verzicht und ist in Sorge, dass der ethische Aufschrei dem ganzen Feld schaden und zu restriktiveren Gesetzen führen könnte.

Was verbirgt sich nun hinter CRISPR-Cas9? Das Akronym steht für ein adaptives Immunsystem, mit dem sich Bakterien und Archaebakterien gegen fremde DNA wehren, etwa wenn sie von einem Bakteriophagen angegriffen werden. Falls die Bakterien ihre erste Begegnung mit dem Bakteriophagen überleben, bauen sie ein kurzes Fragment seiner DNA in ihr Erbgut ein, und zwar in ihren sogenannten CRISPR-Lokus. Dieser Lokus ist damit nichts anderes als ein Archiv für die zur Fahndung ausgeschriebene Fremd-DNA. Damit die Fahndung läuft, wird der Lokus in eine Botenribonukleinsäure übersetzt und in viele kleine Fragmente zerschnitten. Diese Fragmente sind winzige Fahndungsfotos, die crRNAs heißen. Jede dieser crRNAs besteht aus einer zum Abschuss freigegebenen Fremdsequenz und einer fixen bakteriellen Sequenz. Allerdings lässt sich damit noch kein Feind vernichten. Die Französin Emmanuelle Charpentier, die heute am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig arbeitet, hat gezeigt, dass das Präzisionsskalpell nur dann zuschlägt, wenn eine zweite RNA an die crRNA andockt und sich beide mit der eigentlichen Schere, dem Enzym Cas9 verbinden. Erst dieses Tandem bringt die Schere auf Trab. Es sei überraschend gewesen, zu sehen, dass für das punktgenaue Zerschneiden der DNA zwei RNAs und ein Enzym nötig seien, sagt Charpentier, die auch Professorin an der Medizinischen Hochschule Hannover ist. Man hatte zunächst wohl eher damit gerechnet, dass mehrere Enzyme beteiligt seien. Charpentier und Jennifer Doudna von der Universität Kalifornien in Berkeley haben 2012 als Erste demonstriert, welches Potential in der CRISPR-Technologie steckt. Die beiden Frauen sind dafür inzwischen mehrfach ausgezeichnet worden. Charpentier wird im Mai in Hamburg auch den Ernst Jung-Preis erhalten.

Einfach und bedienungsfreundlich

Wie findet CRISPR-Cas9 die feindliche DNA? Auf der Suche nach der zum Abschuss freigegebenen Sequenz gleitet der Komplex aus Cas9 und den beiden RNAs wie ein Schlitten über den DNA-Doppelstrang und stoppt immer dann, wenn er auf ein spezielles, nur aus drei Basenpaaren bestehendes Sequenz-Motiv mit dem Namen PAM trifft. Wegen der Kürze dieses Motivs stoppt der Komplex in schneller Regelmäßigkeit. Bei jedem Halt wird geprüft, ob die als Teil der crRNA mitgeführte Fremdsequenz mit der Sequenzumgebung des PAM-Motivs identisch ist. Ist das der Fall, lagert sich die mitgeführte Fremdsequenz über eine Watson-Crick- Paarung an den komplementären DNA-Strang an und Cas9 zerschneidet beide Stränge. Ist die Sequenzumgebung nicht identisch, steuert der Komplex das nächste PAM-Motiv an und prüft die Umgebung wieder, bis er fündig geworden ist oder nirgendwo eine Fremd-DNA zu finden ist.

Um das Präzisionsskalpell einfacher und bedienungsfreundlicher zu machen, haben Doudna und Charpentier die beiden RNAs zu einer einzigen Führungsnukleotidsequenz, einer sogenannten guideRNA, zusammengeführt. Die heute überall verwendete Variante der Präzisionsschere ist deshalb nur noch ein Zwei-Komponenten-System aus Cas9 und einer guideRNA, kein Drei-Komponenten-System mehr. Es habe sich dann schnell gezeigt, dass diese vereinfachte Form nicht nur in Bakterien funktioniere, sondern mit einigen Anpassungen auch in höheren Lebewesen, und dass mit der passenden guideRNA praktisch jede beliebige Sequenz zur Fahndung ausgeschrieben und punktgenau zerschnitten werden könne, sagt Charpentier über die rasante Entwicklung. Die CRISPR-Technologie ist seitdem bei vielen Organismen eingesetzt worden, unter anderem bei Mäusen, Ratten, Taufliegen, Zebrafischen, Fröschen, Affen, Pilzen, menschlichen Stammzellen und bei vielen Pflanzen.

Ständige Mutationen

Editiert und redigiert wird die DNA bei der Reparatur des Doppelstrangbruchs. Die Zellen benutzen dafür zwei Mechanismen. Beim ersten Mechanismus werden die freien Doppelstrangenden einfach wieder zusammengesetzt Allerdings treten dabei ständig Fehler - Mutationen - auf, weil Basenpaare verlorengehen oder neue Basenpaare eingefügt werden. Durch diese Ungenauigkeiten verändert sich das Leseraster an dieser Stelle des Genoms. Das hat zur Folge, dass die im Leseraster liegenden Gene mutiert und außer Gefecht gesetzt werden, und zwar auf eine weitaus effektivere und präzisere Weise als mit den meisten anderen Methoden. Wissenschaftler können daher mit CRISPR-Cas9 Gene sehr gezielt abschalten und untersuchen, welche Auswirkungen der Verlust auf den Organismus oder den Krankheitsprozess hat. Der Doppelstrangbruch kann auch durch den Einbau einer homologen Sequenz repariert werden, die den Zellen allerdings angeboten werden muss. Auf diese Weise lassen sich neue Gene punktgenau ins Genom einbauen. Man konnte zwar bislang auch schon Gene punktgenau einfügen, aber nicht derart mühelos und derart schnell. Bisher mussten Proteine für diese Aufgabe maßgeschneidert werden, sogenannte „Zinkfinger“ oder „Talen“. Das kann Monate oder Jahre dauern. Für das neue Werkzeug muss nur eine passende guideRNA synthetisiert werden, für deren Fertigung es inzwischen Zulieferer gibt. Jeder Wissenschaftler kann sich heute in kürzester Zeit seine persönliche Schere für den Eingriff ins Genom herstellen lassen. Diese Leichtigkeit im Umgang ist eine wichtige Voraussetzung für viele Anwendungen. Mit der CRISPR-Technologie kann das Genom auch an mehreren Stellen gleichzeitig editiert und redigiert werden. Dazu müssen nur mehrere Präzisionsscheren zeitgleich ins Rennen geschickt werden. Der Phantasie der Wissenschaftler sind im Grunde keine Grenzen gesetzt.

Allerdings gibt es auch Schwierigkeiten. Dazu gehört die sogenannte Off-Target-Aktivität. Das bedeutet, dass der Komplex aus Cas9 und guideRNA den Doppelstrang nicht an der vorgesehenen Stelle im Genom schneidet, sondern auch an ähnlichen Stellen. Die Forscher sind aber schon dabei, Lösungen für dieses Problem zu erarbeiten. Eine dieser Lösungen sieht vor, dass die beiden DNA-Stränge separat angesteuert und zerschnitten werden, jeder mit einer eigenen guideRNA und einer Cas9-Variante, die nur noch einen Strang zerschneidet, nicht mehr beide. Um beide Stränge durchtrennen zu können, müssen dann zwei guideRNAs mit ihren Cas9-Enzymen gleichzeitig andocken, was die Präzision erhöht und die Off-Target-Aktivität deutlich reduziert. Die Wissenschaftler haben inzwischen auch gelernt, dass es günstiger ist, weniger Cas9 in die Zellen zu schleusen. Je mehr Enzymkomplexe in der Zelle herumlungern, desto mehr Fehler werden gemacht. Heute werden daher weniger CRISPR-Elemente in die Zelle geschafft als in den Anfangstagen der Technologie.

CRISPR-Cas9 kann aber noch mehr als editieren und redigieren. Die Technologie kann auch genutzt werden, um jedes beliebige Protein an eine bestimmte Stelle im Genom zu dirigieren. Dazu werden die Proteine direkt an Cas9 angekoppelt. Allerdings wählt man dafür eine Enzymvariante, die keine DNA mehr zerschneiden kann, sondern mit ihrer guideRNA nur die gewünschte Stelle im Genom ansteuert. Auf diese Weise können alle möglichen Eiweiße an kritische Stellen ins Genom dirigiert werden. Etwa solche, die das Ablesen der Gene auf Kommando modulieren, die genaue Position des Gens auf den Chromosomen bekanntgeben und andere Aufgaben übernehmen.

Quelle: F.A.Z.
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